活性氧试剂盒说明书
                          ROS（HY-M0087）KIT
 活性氧（ROS）活性氧又名三原子氧，包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

检测原理：活性氧检测试剂盒采用DCFH-DA探针检测活性氧。DCFH-DA是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。DCFH-DA可被酯酶水解为DCFH，GCFH可被细胞或组织中的活性氧氧化生成荧光物质DCF。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长485 nm，发射波长538 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从而测定细胞或组织中的总活性氧水平。

药盒组成：
试剂一：0.1 ml 10 mmol/L DCFH-DA in DMSO，−20 ºC保存。
试剂二： 1 ml活性氧阳性对照，4 ºC保存。用前1:1000~1:10,000倍稀释。

试剂准备
1、 推荐DCFH-DA 1:10稀释即初始工作浓度为1mmol/L。针对不同的细胞和刺激，DCFH-DA有效工作浓度可在100μmol/L ~2mmol/L宽范围内变动，因此需要进行预试验确定合适的浓度。
2、 活性氧（2 mM H2O2）阳性对照的工作浓度约为100 μM，超过200μM将产生细胞毒。
样本前处理
1、 称取约0.05克组织，按1:20（质量/体积）比例加入冰冷的100mmol/L磷酸缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆。
2、 1000g，4℃离心10分钟，取上清液待测。
操作步骤
1、 在96孔酶标板中加入190μl匀浆上清液，10μl 的1mmol/L DCFH-DA溶液（DCFH-DA终浓度为50μmol/L），用微量移液器吸打，使之充分混匀。
2、 置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长485nm，发射波长538 n m检测荧光强度。
3、另取50μl匀浆上清液，30倍稀释，取100进行蛋白定量。
4、结果以荧光强度/毫克蛋白表示。

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