客户服务
 关 键 字:
 产品类别:
  多肽及试剂盒
  2024年产品目录
实验室分类
      临床检验实验室  
      生化实验室  
      酶标实验室  
      血流变实验室  
      病理实验室  
      特种蛋白实验室  
      免疫印迹实验室  
      流式细胞实验室  
      PCR实验室  
      放免实验室  
      化学发光实验室  
      微生物实验室  
      标本准备实验室  
激素蛋白类放免产品
      甲状腺类  
      肿瘤类  
      生殖、生理、性激素  
      心血管、糖尿病类  
      血液病、肾病及细胞因  
      脑肠肽类  
      固相包被类  
      其他诊断试剂  
      肝纤化类  
      特种蛋白类诊断试剂  
      骨代谢类诊断试剂  
酶标产品类
      细胞因子诊断试剂  
      肝炎类定性产品  
      优生优育类  
      肿瘤系列  
      甲状腺系列  
      多肽及其它  
      其他诊断试剂  
多肽、一抗、二抗
      多肽  
      一抗  
      二抗  
免疫组化试剂盒
      免疫组织化学常用试剂  
      免疫印迹常用试剂  
      免疫组化标本前处理试  
ELISA试剂盒
      甲状腺类  
      肿瘤类  
      生殖、生理、性激素类  
      心血管、糖尿病类  
      肝纤化类  
      血液类  
      肾病类  
      细胞因子类  
      特种蛋白类  
      骨代谢类  
      脑肠肽、神经肽类  
      其他诊断试剂  
实验与交流
华英实验中心
      华英实验中心  
包装与运输
其它诊断试剂
      化学发光免疫分析试剂  
      化学发光检测试剂盒  
      血细胞分析仪试剂  
      细胞凋亡检测试剂盒  
      细胞因子  
      生化试剂  
      金标快速检测试剂  
抗凝剂
 
您的位置:首页 >> 产品介绍 >> 荧光定量PCR实验步骤
 
 

荧光定量PCR实验报告

一、实验器材及试剂

1、  实验器材

名称

厂家

型号

离心机

安徽中科中佳

台式高速冷冻离心机KDC-140HR

多样品研磨珠均质仪

上海净信

Tissuelsyer-32

荧光定量PCR

上海宏石

SLAN-96P

超净工作台

力辰科技

SW-CJ-2D

标准试剂型纯水仪

青岛富勒姆科技有限公司

FBZ2001-up-p

离心管

Axygen Biosciences


TIP

Axygen Biosciences


2、  主要实验试剂及耗材

试剂

厂家

货号

Trizol Reagent

Invitrogen Life   Technologies

15596-026

三氯甲烷

国药集团化学试剂有限公司

10006818

异丙醇

国药集团化学试剂有限公司

80109218

无水乙醇

国药集团化学试剂有限公司

10009218

HyPure TMMolecular   Biology Grade Water

HyClone

SH30538.02

RevertAid First Strand cDNA   Synthesis Kit

Thermo

#K1622

FastStart Universal   SYBR Green Master(Rox)

Roche

04 913 914 001

引物

Invitrogen   Biotechnology Co., LTD


75%乙醇:HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制

离心管、TIP头均购湿热灭菌40min,干燥。


 

二、荧光定量PCR实验步骤

1、总RNA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)

1)取匀浆器,加入1mlTrizol Reagent,置冰上预冷。

2)取100mg组织,加入到匀浆器中。

3充分研磨直至无可见组织块。

413000g离心10min取上清。

5)加入250 μl三氯甲烷,颠倒离心管15s,充分混匀,静置3min

6413000g离心8min

7)将上清转移到一新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀。

8-20放置15min

9413000g离心10min,管底的白色沉淀即为RNA

10)吸除液体,加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11413000g离心5min

12)将液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹3min

13)加入20μlRNA酶的水溶解RNA

1455孵育5min

2、反转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌,无RNA酶)

1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。

2)加入1μl oligo(dT)18

3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl

4)于PCR仪上70保温5min,迅速置冰上冷却。

5)依次加入4μl  5×buffer2μl  10mM dNTPs1μl RNA inhibitor1μl 反转录酶,用枪抽吸混匀。

6)于PCR仪上42℃保温60min,结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制2管。

体系

20ul

25ul

50ul

2XGreen qPCRMix

10ul

12ul

25ul

引物F

0.5ul

1ul

2ul

引物R

0.5ul

1ul

2ul

cDNA模板

0.5ul

1ul

1ul

DdH2O

8.5ul

10ul

20ul

总体积

20ul

25ul

50ul

例如25ul体系,每管中加入2XGreen qPCRMix  12ul, cDNA模板1ul, 引物F 1ul, 引物R 1ul , DdH2O  10ul.  短离心,可上机。

 

2)PCR反应程序设置

循环数

步骤

温度

时间

1

1(预变性)

95

2min

35-45

1(变性)

95

15sec

2(延伸)

55--68

20-60sec

1

1(降温)

45

20sec

1

1(溶解曲线)

45--90


备注:延伸和溶解曲线要选荧光定量。

延伸和溶解曲线要选荧光定量。

PCR延伸温度可根据引物的Tm值,GC含量设定。

4、结果处理

ΔΔCT法:

A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)

B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)

K=A-B

表达倍数=2-K


 
北京华英生物技术研究所 版权所有
免费电话:8008109828 邮编:100036 北京华英生物技术研究所 电话:(010)56146198 (010)88114651 传真:(010)88112680
QQ客服:1749417768 客户服务 网 址:北京华英生物技术研究所 www.sinoukbio.com   E-Mail: sinouk@163.com 
京ICP备09006766号