TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书

TSRS-001（TUNEL ApoptosisDetectionKit Ⅱ，AP）

保存条件：-20℃冰冻保存。

保存期：一年

工作原理

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色 质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切 酶被激活，细胞自身的染色质或 DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生与 DNA 断点数目相同 的 3’-OH 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase）可以将地高辛标记 的 dUTP（DIG-dUTP）标记至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 结合在 DNA 断点部位，可以通过生物素化抗 地高辛抗体（Anti-DIG-Biotin）和 SABC-AP 反应后，加入显色底物 BCIP/NBT 予以显示。凋亡的细 胞核呈紫蓝色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。

试剂盒内容

1.标记缓冲液(LabelingBuffer) 3ml

2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 50μl

3.DIG-dUTP(×20) 50μl

4.封闭液(BlockingReagent) 10ml

5.生物素化抗地高辛抗体(×100) 50μl

6..SABC-AP(×100) 50μl

7.ProteinaseK(×200) 125μl

8.BCIP/NBT 显色剂(×20) 0.5ml

9.抗体稀释液 10ml

10.阳性对照片 2 张

用户自备试剂

1. 多聚赖氨酸或 APES(博士德公司有售)。

2. 0.01MTBS（pH7.5）(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克氯化钠,1.2 克 Tris 和 0.45—0.5ml 纯乙酸。)

3. 0.01MTBS,pH9.0--9.5(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克氯化钠,1.2 克 Tris )。

4. 核固红—复染用。

5. 水溶性封片剂。

操作步骤

1. 样品处理

(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或 APES 进行处理。

(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用 4%多聚甲醛/0.01MPBS(pH7.0---7.6)室温下固定 30—60 分钟。PBS 洗 2 分钟×2 次。蒸馏水洗涤 2 分钟×2 次。

(3) 组织：应及时固定。常规 4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或 10%中性缓冲福尔马林固定 4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。

2. 新鲜配制 3%H2O2室温处理 10 分钟。蒸馏水洗涤 2 分钟×3 次。

3. 标本片加 0.01MTBS（pH7.5）1:200 新鲜稀释 ProteinaseK37℃消化 1—15 分钟,TBS 洗 2 分钟 ×3 次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或仅消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10 分钟。陈 旧石蜡切片消化 10-15 分钟)。

4. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer),20μl/片,以保持切片湿润。然后按每张切片取 TdT 和 DIG-d-UTP 各 1μl，加入 18μl 标记缓冲液中，混匀，甩去切片上多余液体后加混合的标记液，20μl/ 片。置样品于湿盒中，37℃标记 2 小时。

5. 0.01MTBS（pH7.5）洗 2 分钟×3 次。

6. 加封闭液 50μl/片，室温 30 分钟，甩掉封闭液，不洗。

7. 用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗地高辛抗体：（取 1ml 抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗 体 10μl），混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中， 37℃反应 30-60 分钟。 0.01MTBS（pH7.5） 洗 2 分钟×3 次。

8. 用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC-AP：取 1ml 抗体稀释液加 SABC-AP 10μl，混匀后 50μl/片加 至切片。37℃反应 60 分钟。0.01MTBS（pH7.5）洗 5 分钟×4 次。

9. BCIP/NBT 显色：BCIP/NBT（×20）按 1：20 的比例用 0.01MTBS (pH9.0-9.5)稀释，混匀。显色 液加至标本上。避光显色 20-30 分钟，若无背景出现则可继续显色。充分水洗。

10. 必要时可用核固红等复染。水溶性封片剂（博士德有售）封片，也可简单地用甘油封片。镜检。

结果判定 细胞核中有紫蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项 1.试剂盒严格-20℃存放。 2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 3 分钟，使试剂沉至管底。 3.检测过程中切勿使样品干涸。 4.BCIP/NBT 显色较慢，可适当延长显色时间。

有效期：  12个月（2-8℃）。

批号：20200110

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