巨噬细胞呼吸爆发实验操作步骤
一.试剂:
1. L-15培养基(含青霉素100IU/ml,链霉素100ug/ml,10IU/ml肝素,2%小牛血清):100mlL-15培养基(加入62.5mg/ml 的青霉素(1600IU/mg)100ul, 100mg/ml链霉素100ul,100mg/ml 肝素钠盐(100IU/mg)100 ul, 小牛血清2ml);
2. HBSS缓冲液:NaCl:8g;KCl:0.4 g;葡萄糖:1.0g;KH2PO4: 60mg;NaH2PO4•H2 O:90mg 100ml去离子水定容,pH用0.1mol/L NaOH 调至7.2(用0.22um过滤膜消毒),使用时10倍稀释。
3. 34% Percoll溶液:17ml Percoll溶液,5ml HBSS(×10),用去离子水定容至50m
4. 51% Percoll溶液:25.5ml Percoll溶液,5ml HBSS(×10),用去离子水定容至50ml
5. NBT:将10mlNBT溶于10ml 1*HBSS中(用前取1ml 10*HBSS加入到9ml离子水中)
6. PMA:将1mlPMA溶于1ml无水乙醇,分装到200ulPCR管中,每10ul,共100管,保存到-20℃冰箱
7. NBT/PMA(1mg/mlNBT含1ug/mlPMA);将10ulPMA储备液加入到10mlNBT溶液中(现配现用)
8.KOH(2mol/L)称取5.6gKOH溶于50ml去离子水
二.具体操作步骤
1. 1、加入200ul L-15培养基到2ml EP管中,取10尾鱼的脾脏混为一个样放入2ml EP管中取样过程无菌操作,样品放在冰盒上。脾脏过100um尼龙筛网,用注射器橡胶头研磨,同时用200-250 ul的L-15培养基冲洗(用50ml 离心管接研磨液)
2、取新的1.5ml EP管,按顺序加入400ul 51% Percoll溶液—750ul 34%Percoll溶液—200-250ul样品悬液
3、4℃,400g离心25min,用移液管吸取分布在34%/51%Percoll溶液的细胞,放入1.5ml EP管中,用1ml L-15培养基洗2次(1000g,10min,4℃)
4、血球计数板统计样品悬液的活细胞数,用L-15培养基调整细胞浓度至3*107cfu/ml
5、取100ul稀释后的悬液放入1.5ml EP管中,4℃,1000g离心10min,弃上清
6、加入1ml HBSS洗巨噬细胞2次
7、加入100ul NBT/PMA溶液,18-20℃遮光孵化45min(现配先用,用前将PMA加入NBT,注意避光)
8.加入100ul无水甲醇终止反应,静置10分钟,4℃,2000rpm离心10min,弃上清
9.用70%的甲醇洗3次(2000rpm,10min),风干
10.加入120ul 2M KOH和140ulDMSO涡旋震荡,溶液应呈淡蓝色
11.溶解后在630nm波长下,酶标扳每孔加入260ul反应液,以KOH/DMSO作空白测定各离心管溶液的吸光度