活性氮试剂盒操作说明书 RNS（HY-M0097）KIT 活性氮(reactive nitrogen species，RNS)是指NO 与包括活性氧在内的化合物相互作用,生成一系列包括ONOO·及其质子形式过氧亚硝酸(HOONO)等具有高度氧化活性的自由基和硝基类化合物,这些与活性氧相对应的以NO 为中心的衍生物称为活性氮。活性氮主要包括氮氧化物一氧化氮(NO)和二氧化氮(NO2)、过氧化亚硝酰阴离子(ONOO·)、亚硝酰氢(HNO)、亚硝酸根离子(NO2-)和氨等。 检测原理：
活性氮检测试剂盒是一种利用荧光探针R21 进行活性氮检测的试剂盒。R21探针本身荧光很弱，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成R21D。而R21D不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氮存在的条件下，R21D 与活性氮反应生成强荧光物质R21F，R21F发出的绿色荧光强度与细胞内活性氮水平成正比，检测R21F 的荧光就可以知道细胞内活性氮的水平。R21F 的荧光最大激发波长是490nm，最大发射波长是516nm。
活性氮检测试剂具有高的灵敏度，良好的选择性，短的响应时间，以及可对检测对象在原位进行实时监控和观察等。更重要的是，这种检测技术对细胞内活性氮的内源性分布不产生巨大的外加干扰，从而能最大程度地得到内源性活性氮变化的真实信息。
在激发波长488 nm，发射波长516 nm 附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测R21F荧光，从而测定细胞内活性氮水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。 操作步骤： 1． 探针染色工作液配制：
根据样本数量，用HBSS将R21荧光染料100倍稀释，配制成染色工作液。
【注】:
● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或PBS 稀释储存液到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度100-1000 倍稀释。
● 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和线粒体毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。另外，浓度过高也可能造成非特异性染色，对其他细胞结构进行染色。
● 工作液现配现用。
2．细胞探针标记
2.1对于贴壁细胞，可以进行原位标记
1)培养皿/培养板准备细胞样本。
2)待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育20 分钟～30 分钟(具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化)。
【注】:
● 也可以将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
3)移除染色液，用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。
【注】:
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
4)荧光显微镜(含合适滤片)或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为488/516nm。
2.2对于悬浮细胞
1)离心，吸除上清。
2)利用37℃预热的探针工作液100-200ul 重悬细胞，于生长状态下孵育20 分钟～30 分钟(具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化)。
3)离心，吸除染色液，加入PBS(pH7.4)重悬细胞，洗涤3次。
4)流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为488 / 516nm。
【注】:
●对于悬浮细胞，也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上，然后使用类似于贴壁细胞的方法进行染色。
● 如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前可以先用多聚赖氨酸(poly-D-lysine)包被载玻片或盖玻片。
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
3．检测：
对于原位标记探针的样品可以用荧光显微镜，激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察亦可。
使用488nm激发波长，516nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
R21F的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置进行检测。 2． 使用方法：
使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
●荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
●对于药物作用时间较短(小于2 小时)的细胞，可以先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6 小时以上)的细胞，先用相应的药物刺激细胞，后标记探针。
● R21染色液为DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO 溶液集中于管底。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
●标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
● 酚红对R21荧光探针的检测有干扰，需避免。
●染色后立即进行分析。
● 以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高R21 探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60 分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。 生产日期：2017-09-25 有效日期：2018-01-25 生产批号：20170925地址：北京市海淀区上地信息路2号上地七街国际创业园东区1号楼12层12A 北京华英生物技术研究所 邮编：100085 电话：010-88114651 传真：010-88112680 免费电话：8008109828
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